納米技術(shù)因優(yōu)良理化性質(zhì)，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、電子、食品等多個(gè)領(lǐng)域，但大規(guī)模生產(chǎn)與使用增加了人類對(duì)納米材料（NMs）的暴露風(fēng)險(xiǎn)，其對(duì)人體健康和環(huán)境的潛在不利影響催生了納米毒理學(xué)這一學(xué)科。然而納米材料具有異質(zhì)性，且缺乏標(biāo)準(zhǔn)化評(píng)估技術(shù)，從而導(dǎo)致傳統(tǒng)檢測(cè)方法（如比色法、常規(guī)流式細(xì)胞術(shù)（FC））易受納米材料特異性干擾，產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果；且常規(guī)流式細(xì)胞術(shù)需進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記，進(jìn)一步增加了納米材料與試劑、熒光物質(zhì)相互作用的干擾風(fēng)險(xiǎn)。這些干擾具有顆粒、濃度和檢測(cè)方法的特異性，需單獨(dú)優(yōu)化，使得納米毒性檢測(cè)難度大、耗時(shí)且成本高昂。因此，亟需開(kāi)發(fā)無(wú)干擾的一線篩選方法，即在研發(fā)早期識(shí)別有毒納米材料及對(duì)應(yīng)的濃度、時(shí)間節(jié)點(diǎn)的篩選方法，進(jìn)而為后續(xù)機(jī)制研究提供線索，從而節(jié)省人力和財(cái)力資源。
Ampha Z32非標(biāo)記微流控阻抗流式細(xì)胞儀（IFC法）與現(xiàn)有檢測(cè)手段的不同之處在于，它能夠通過(guò)寬頻率范圍對(duì)單個(gè)細(xì)胞的電學(xué)特性進(jìn)行高通量測(cè)量。其可同時(shí)在多個(gè)頻率下進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞大小、膜特性和細(xì)胞內(nèi)特性的檢測(cè)以深入了解細(xì)胞狀態(tài)。無(wú)標(biāo)記特性意味著細(xì)胞在檢測(cè)前不會(huì)被化學(xué)試劑修飾或經(jīng)過(guò)復(fù)雜處理。重要的是在納米毒性測(cè)試中，這一特性還能顯著降低納米材料誘導(dǎo)干擾的可能性。
本研究從一線篩選方法的角度，結(jié)合納米材料可能引發(fā)的干擾，評(píng)估了Ampha Z32非標(biāo)記微流控阻抗流式細(xì)胞儀（IFC法）在體外納米毒性測(cè)試中的適用性。此外，該項(xiàng)研究還以U937人淋巴瘤細(xì)胞為模型，將其暴露于8種OECD參考納米材料（二氧化鈦（TiO?）NM-100和NM-101、二氧化硅（SiO?）NM-200和NM-203、氧化鋅（ZnO）NM-110和NM-111、銀（Ag）NM-300K和NM-302），進(jìn)而對(duì)IFC檢測(cè)方法進(jìn)行了優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)化，并將其可靠性與兩種傳統(tǒng)檢測(cè)方法（臺(tái)盼藍(lán)染色排除法和傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀）進(jìn)行了對(duì)比。
Ampha Z32（IFC法）在納米材料毒性檢測(cè)中的適用性
不同檢測(cè)緩沖液下Ampha Z32（IFC法）對(duì)U937細(xì)胞的檢測(cè)效果
不同檢測(cè)頻率下，失活細(xì)胞（綠色）與活性細(xì)胞（紅色）的分離（IFC法）
利用Ampha Z32（IFC法）可實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞、壞死細(xì)胞及小型校準(zhǔn)微球的分離
通過(guò)Ampha Z32（IFC法）檢測(cè)的NM-300K（Ag，100μg/ mL）對(duì)U937細(xì)胞的急性毒性效應(yīng)。活細(xì)胞（紅色），暴露在NM-300K中10min（藍(lán)色），暴露在NM-300K中30min（紫色）和壞死細(xì)胞（綠色）
研究結(jié)果表明，Ampha Z32非標(biāo)記微流控阻抗流式細(xì)胞儀（IFC法）在所有測(cè)試中均未檢測(cè)到納米材料的相關(guān)信號(hào)，也就是說(shuō)所測(cè)試的8種具有不同化學(xué)組成、大小、形狀和表面涂層的金屬和金屬氧化物納米材料，均未對(duì)Ampha Z32的檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生干擾。此外，Ampha Z32還檢測(cè)到了NM-300K（Ag，100μg/ mL）對(duì)U937細(xì)胞產(chǎn)生的急性毒性效應(yīng)，可見(jiàn)Ampha Z32非標(biāo)記微流控阻抗流式細(xì)胞儀（IFC法）具有無(wú)標(biāo)記的特點(diǎn)，不易受納米特異性干擾，是一種有效、環(huán)保且可靠的納米材料誘導(dǎo)毒性檢測(cè)工具。
Ampha Z32（IFC法）的可靠性
劑量反應(yīng)曲線（TB&IFC）?；疑摓殛幮詫?duì)照，即健康細(xì)胞的平均值“SE”（%）。與對(duì)照組（0μg/ml）相比，單次方差分析（n≥3）結(jié)果顯示，毒性效應(yīng)具有統(tǒng)計(jì)性意義（P ≤ 0.05、**P ≤ 0.01和**P≤ 0.001）
Ampha Z32（IFC法）與Countess（TB染色法）對(duì)8種納米材料的劑量-反應(yīng)曲線表明，兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)相關(guān)性極高（R2值接近1），且Ampha Z32單次樣本可分析10000-20000個(gè)細(xì)胞，遠(yuǎn)多于TB染色法（200-300個(gè)），因此能更精準(zhǔn)反映納米材料的毒性效應(yīng)。此外，經(jīng)參數(shù)優(yōu)化后（6MHz、緩沖液（PBS: 0.28M蔗糖= 1:4）、0.02Vtrigger level(V)）后，Ampha Z32不僅可以清晰區(qū)分活細(xì)胞、壞死細(xì)胞及不同尺寸顆粒，還能檢測(cè)細(xì)胞死亡早期階段（凋亡），比TB染色法更靈敏。
傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀（FC，左）& Ampha Z32（IFC，右）測(cè)量結(jié)果對(duì)比。陰性對(duì)照（未暴露細(xì)胞，紅色）、陽(yáng)性對(duì)照（加熱處理細(xì)胞，綠色）和TNF-α/CHX + NM-100處理組（藍(lán)色）
盡管Ampha Z32（IFC法）與Countess（TB染色法）的檢測(cè)結(jié)果一致，但Ampha Z32（IFC法）和傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀（BD LSR Fortessa）的檢測(cè)結(jié)果卻存在較大差異，這是由于傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀（FC）易受納米材料特異性干擾。例如NM-100（TiO?納米顆粒）會(huì)與FC染色劑或讀數(shù)系統(tǒng)相互作用，導(dǎo)致凋亡誘導(dǎo)劑（TNF-α/CHX）處理組的活細(xì)胞群體（Annexin-V?/7-AAD?）被高估，導(dǎo)致活力數(shù)據(jù)嚴(yán)重偏離真實(shí)值。同時(shí)納米材料還會(huì)吸附染料、充當(dāng)熒光猝滅劑/增強(qiáng)劑，或散射/吸收光線，直接干擾光學(xué)信號(hào)的準(zhǔn)確性。而Ampha Z32（IFC法）基于細(xì)胞阻抗信號(hào)（電阻+電抗）分析細(xì)胞狀態(tài)，無(wú)需熒光染料或化學(xué)標(biāo)記。納米材料不會(huì)與阻抗檢測(cè)的電學(xué)信號(hào)產(chǎn)生相互作用，僅細(xì)胞自身狀態(tài)（膜完整性、大小等）影響檢測(cè)結(jié)果，無(wú)額外干擾源，該研究團(tuán)隊(duì)在近期的研究中已將其成功應(yīng)用于骨再生支架用納米金剛石（非金屬納米材料）的毒性評(píng)估中，可見(jiàn)Ampha Z32（IFC法）在體外納米毒性評(píng)估中具有優(yōu)勢(shì)顯著。
與許多傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，Ampha Z32（IFC法）不使用有毒或?qū)Νh(huán)境有害的試劑，更具環(huán)保性，可輕松適配于評(píng)估更大顆粒、化學(xué)品和藥物的效應(yīng)，是一種可靠性，是穩(wěn)定、可信的細(xì)胞活力評(píng)估工具，不僅可作為納米毒性一線篩選的優(yōu)選方法，尤其適用于作為活力檢測(cè)的一線篩選工具。 Ampha Z32 已升級(jí)為 Ampha X30，其針對(duì)從微小細(xì)菌、藻類、酵母到大型哺乳動(dòng)物細(xì)胞等各類樣本，預(yù)設(shè)了最佳測(cè)試模板。設(shè)備內(nèi)置程序化沖洗功能，每個(gè)樣本檢測(cè)后自動(dòng)執(zhí)行沖洗，既防止芯片與管路堵塞，更能避免樣本殘留引發(fā)的交叉污染，操作與維護(hù)更便捷。
原文：Ostermann, M., Sauter, A., Xue, Y. et al. Label-free impedance flow cytometry for nanotoxicity screening. Sci Rep 10, 142 (2020).