提速小麥單倍體技術(shù)產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程——原創(chuàng)小麥單倍體花青素標(biāo)記鑒別系統(tǒng)
日期：2023-03-08 17:31:35
小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一，為人類提供約20%的食物熱量。隨著全球人口的增加，2050年小麥產(chǎn)量需要提高70%，培育優(yōu)良品種是提高產(chǎn)量的有效途徑。然而，使用傳統(tǒng)方法非常耗時，培育一個新的小麥品種通常需要至少8-10年。但通過雙單倍體（Doubled Haploid，DH）育種技術(shù)的運(yùn)用，純系只需1-2個世代即可產(chǎn)生，顯著縮短育種周期，大大加快了育種進(jìn)程。DH系生產(chǎn)包括3個環(huán)節(jié)，即單倍體誘導(dǎo) 、單倍體加倍和DH系繁殖與鑒定，每個環(huán)節(jié)都對純系的生產(chǎn)效率至關(guān)重要。
在小麥單倍體誘導(dǎo)環(huán)節(jié)，前期中國農(nóng)業(yè)大學(xué)團(tuán)隊研究團(tuán)隊通過敲除玉米單倍體誘導(dǎo)關(guān)鍵基因ZmPLA1的同源基因，率先在小麥中建立了單倍體誘導(dǎo)(haploid induction, HI) 技術(shù)體系，單倍體誘導(dǎo)效率高于20%。小麥單倍體技術(shù)體系雖有了高效的誘導(dǎo)技術(shù)，但是該技術(shù)的應(yīng)用仍需解決小麥單倍體鑒別等問題，開發(fā)高效的標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)小麥單倍體鑒別(haploid identification, HID) 的核心。2023年3月1日， Plant Communications在線發(fā)表了中國農(nóng)業(yè)大學(xué)陳紹江、劉晨旭團(tuán)隊題為“Establishment of an efficient haploid identification system by engineering anthocyanin accumulation in wheat embryo”，該研究利用玉米花青素調(diào)控基因ZmC1和ZmR，成功創(chuàng)制了小麥紫胚芽鞘誘導(dǎo)系PCI和紫胚誘導(dǎo)系PEI，實(shí)現(xiàn)了小麥單倍體的精準(zhǔn)鑒別，并利用PEI誘導(dǎo)系成功創(chuàng)制了DH系，展現(xiàn)了該技術(shù)在小麥育種中的應(yīng)用前景。前人研究表明ZmC1和ZmR可以調(diào)控植物花青素合成，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)研究團(tuán)隊為了測試使用ZmC1和ZmR進(jìn)行小麥HID的可行性，評估了轉(zhuǎn)基因品系A(chǔ)L-30和AL-40的色素沉著情況，這些品系分別含有pUbi驅(qū)動的ZmC1和pUbi驅(qū)動的ZmR。AL-30和AL-40在胚胎和種皮分別出現(xiàn)色素沉著（圖1A）。除此以外，在胚胎或胚乳中沒有發(fā)現(xiàn)AL-30、AL-40和野生型之間的差異。接下來，通過將AL-30和AL-40雜交，研究團(tuán)隊創(chuàng)造了一個同時具有ZmC1和ZmR的F1。結(jié)果表明，成熟的胚胎（ME），未成熟的胚胎（IE）和F1果核的外胚層都顯示出深紫色色素，表明ZmC1和ZmR能協(xié)同促進(jìn)花青素的積累(圖1A）。然而，ZmC1和ZmR的同時過表達(dá)也導(dǎo)致導(dǎo)致葉片強(qiáng)烈的色素沉著，嚴(yán)重阻礙了幼苗的生長，最終導(dǎo)致死亡。因此，不能簡單地將pUbi驅(qū)動的ZmC1和ZmR用于小麥的HID。研究團(tuán)隊將組成型表達(dá)ZmC1的材料AL-30與誘導(dǎo)系進(jìn)行雜交，通過分子標(biāo)記與表型輔助選擇，育成了紫胚芽鞘誘導(dǎo)系PCI。利用該誘導(dǎo)系雜交的后代，根據(jù)胚芽鞘顏色可實(shí)現(xiàn)單倍體精準(zhǔn)鑒別（圖1B-C），單倍體鑒別準(zhǔn)確率為96.3%（圖1G-H）。圖1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)研究團(tuán)隊建立的高效小麥HID系統(tǒng)為了在種子階段實(shí)現(xiàn)可視化的HID，研究團(tuán)隊確定了一個胚胎偏好的啟動子Oleosin-like基因—TaOle。TaOle的1419bp啟動子片段與ZmR和ZmC1的CDS融合，構(gòu)成pTaOle驅(qū)動的ZmR-P2A-ZmC1表達(dá)載體（圖1D）。將該載體被轉(zhuǎn)化到小麥單倍體誘導(dǎo)系TaPLA-4A和TaPLA-4D中，結(jié)果表明所有四個陽性轉(zhuǎn)基因植株在IE和ME中都顯示出深紫色的色素沉著，但在其他組織中沒有染色，表明pTaOle在轉(zhuǎn)基因植物的胚胎中工作良好（圖1E）。更重要的是，這些轉(zhuǎn)基因植物的生長和發(fā)育沒有受到影響，這是對AL-30和AL-40的F1雜種的巨大改良。在T1代中，具有ZmR-P2A-Zm純合基因型的個體被篩選并命名為紫色胚胎誘導(dǎo)系（PEI）。為了測試HID的性能，我們用CS、JW1和MR-H的胚胎供體植物與花粉來自同源的T1 PEI植物的花粉雜交。根據(jù)IE和ME中色素沉著的缺失情況，篩選出推測的單倍體（圖1F），并通過流式細(xì)胞儀和表型進(jìn)一步驗(yàn)證（圖1G）。在IE階段，有11個和9個推定的單倍體分別來自CS和JW1，后被驗(yàn)證為真正的單倍體；在ME階段，有2個、6個和3個假定的單倍體分別來自CS、JW1和MR-H。倍性分析的結(jié)果顯示分析結(jié)果顯示，只有MR-H的一個推定單倍體被發(fā)現(xiàn)是二倍體（6N）。為了進(jìn)一步評估HID的準(zhǔn)確性，在T2代中篩選了13個假定的CS單倍體，所有這些都被證實(shí)是真正的單倍體。因此，在IE和ME階段的總體HID準(zhǔn)確性為97.7%（圖1H）。同樣的方法用于驗(yàn)證18個假定的二倍體(6N）的紫色胚胎，所有這些胚胎都被確認(rèn)為真正的二倍體（6N）。上述結(jié)果表明，PEI可以實(shí)現(xiàn)小麥的高效HID。此外，研究團(tuán)隊將F1雜交種（CS×Fielder）與PEI雜交，產(chǎn)生單倍體用于染色體加倍?？偣搏@得11個單倍體，所有的單倍體在秋水仙素處理后都加倍了。為了研究DH是否在所有的染色體上都是純合的，用靶向測序技術(shù)對11個DH的基因組進(jìn)行了基因分型。9158個單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的生物信息學(xué)分析顯示，沒有一個DH攜帶雜合的位點(diǎn)（圖1I），表明PEI可以誘導(dǎo)純合子，并可能成為小麥DH育種的一個前景廣闊的工具。該研究原創(chuàng)的小麥單倍體花青素標(biāo)記鑒別系統(tǒng)，為新型小麥單倍體育種技術(shù)從理論研究到實(shí)踐應(yīng)用邁出了一大步，提速小麥單倍體技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程，對于加快小麥育種進(jìn)程具有里程碑式的意義。綜上所述， DH育種因具備周期短、純度高等優(yōu)點(diǎn)，獲得了國內(nèi)外各大農(nóng)業(yè)公司及育種單位的密切關(guān)注。對于種業(yè)公司來說，早日推出優(yōu)異新品種就可以早日獲取效益，而對于育種家們來說，縮短育種周期、加快育種速度是他們畢生的奮斗目標(biāo)。隨著單倍體誘導(dǎo)關(guān)鍵調(diào)控基因的進(jìn)一步挖掘和基因編輯技術(shù)的聯(lián)合使用， DH育種技術(shù)已經(jīng)不僅僅局限在玉米純系的創(chuàng)制上，其應(yīng)用也由玉米拓展到單子葉作物水稻、小麥、谷子，以及雙子葉擬南芥、蒺藜苜蓿、番茄、煙草等多種植物上，未來 DH育種技術(shù)在作物育種和改良上將發(fā)揮更大的作用，糧食作物以及蔬菜經(jīng)濟(jì)作物工廠化應(yīng)用將很快到來。
實(shí)驗(yàn)室-溫室-田間的一體化DH生產(chǎn)服務(wù)北大荒墾豐種業(yè)-澤泉科技生物技術(shù)與表型服務(wù)中心是由北大荒墾豐種業(yè)股份有限公司和上海澤泉科技股份有限公司共同建設(shè)的開放式高通量植物基因型-表型-育種服務(wù)平臺。中心建立了基因克隆和載體平臺、作物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、基因型分析平臺、表型鑒定分析平臺、數(shù)據(jù)分析和利用平臺等現(xiàn)代化生物技術(shù)和信息支持平臺，是定位于為植物科研和作物育種提供植物基因型-表型-育種數(shù)據(jù)分析的科研服務(wù)平臺。為了縮短您的育種進(jìn)程，提高您的育種成功率，北大荒墾豐種業(yè)澤泉科技生物技術(shù)與表型服務(wù)中心將為您提供一體化DH生產(chǎn)服務(wù)。我們提供DH服務(wù)技術(shù)流程：從實(shí)驗(yàn)室——溫室——田間一體化服務(wù)。父本誘導(dǎo)系誘導(dǎo)母本材料，孤雌生殖，產(chǎn)生單倍體種子（幼胚）。20-60份/皿。置于人工培養(yǎng)室（帶光照層架）或人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時左右。將幼胚在體視熒光顯微鏡下觀察或者在日光燈下觀察，以自交系所得幼胚為對照。因?yàn)殡s合二倍體含有父本基因，所以單倍體有微弱熒光或無色。將挑選的擬單倍體直接置于含有加倍藥劑（秋水仙素）的MS培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)；后轉(zhuǎn)入不含加倍藥劑的MS培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)后光照培養(yǎng)，待幼苗2葉一心時移至培養(yǎng)瓶中（MS培養(yǎng)基）。將培養(yǎng)瓶中DH系幼苗在4葉一心時移栽至苗缽，在溫室中煉苗。待幼苗5-6葉期移栽至溫室花盆或大田，待散粉時，及時套袋進(jìn)行自交授粉。田間收獲和鑒別。如果用采用花藥離體培養(yǎng)單倍體的方法，則省去觀察幼胚的步驟，其余步驟基本相同。花粉作為一種重要的種質(zhì)資源，被廣泛利用到科學(xué)研究、新品繁育、農(nóng)業(yè)研究、種子生產(chǎn)等領(lǐng)域中。通常，花粉容易受到光照、溫度、濕度等環(huán)境因素的影響，因此花粉活力檢測是育種和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中必不可少的檢測指標(biāo)。篩選高活性的花粉進(jìn)行授粉可以提高作物結(jié)籽率、果品品質(zhì)，提高產(chǎn)量預(yù)測的準(zhǔn)確性，進(jìn)而減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中不必要的損失。傳統(tǒng)上進(jìn)行花粉活力檢測主要通過染色法和體外萌發(fā)法，然而這兩種方法費(fèi)時耗力、通量低、適用性及統(tǒng)計性差，往往不能滿足育種、生產(chǎn)過程中的日常需求?；ǚ刍盍Ψ治鰞x通過檢測流經(jīng)交流電場的花粉顆粒的電阻抗特性，實(shí)時獲取大量花粉顆粒的大小、活性、濃度等數(shù)據(jù)。該方法已應(yīng)用于上百種植物花粉活性的檢測，是一種高效、可靠且標(biāo)準(zhǔn)化的檢測技術(shù)。澤泉科技AgriPheno平臺已引進(jìn)Ampha? Z40花粉活力分析儀并向廣大育種家和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者推出花粉活力的檢測分析服務(wù)。DH育種是利用誘導(dǎo)系誘導(dǎo)（或花藥離體培養(yǎng)等手段誘導(dǎo)）產(chǎn)生單倍體植株，再通過染色體組加倍（自然加倍或藥劑處理）使植物恢復(fù)正常染色體數(shù)的育種方法。由于自然單性生殖或孤雄生殖單倍體非常罕見，因此單倍體的獲得成為單倍體育種的一個難點(diǎn)，游離小孢子培養(yǎng)是獲得單倍體的重要手段之一?；ǚ刍盍Ψ治鰞x（阻抗流式細(xì)胞技術(shù)，IFC）可以在DH育種過程中，幫助選擇小孢子植物供體，評估小孢子胚誘導(dǎo)策略，優(yōu)化培養(yǎng)條件，并在小孢子培養(yǎng)早期進(jìn)行產(chǎn)胚量的準(zhǔn)確預(yù)測，可顯著提高游離小孢子培養(yǎng)的成功率，進(jìn)而加快DH育種的效率。花粉的形成受到遺傳因素的嚴(yán)格控制，而當(dāng)控制花粉發(fā)育的基因發(fā)生突變時將導(dǎo)致花粉質(zhì)量降低、花粉數(shù)量減少或是完全沒有花粉。雜交育種過程中，花粉敗育的雄性不育系是理想的母本，而任意環(huán)境下具備大量高活性花粉的雄性可育系則是理想的父本。優(yōu)化花粉發(fā)育條件，篩選優(yōu)質(zhì)、高抗品種花粉活性通常會受到光、熱溫度、農(nóng)藥等環(huán)境因素的影響，可以通過不同條件下花粉的活性來確定花粉生長的理想條件，或篩選優(yōu)質(zhì)、高抗品系。下圖為五種不同植物花粉對溫度變化的響應(yīng)，如圖所示，某些花粉是可以暴露在50℃的高溫下的（粉色），而其他花粉則在45℃就逐漸失活。這表明每一種花粉都有其理想的生長溫度，獲得高活性花粉不能超過其理想生長溫度。育種和生產(chǎn)過程中，通常會遇到花期不育的問題，這就需要提前采集花粉，保存?zhèn)溆?。但自然條件下，絕大多數(shù)植物花粉的壽命都較短，而且容易受溫度、光照等因素的影響，因此，何時收獲花粉，收獲后如何保存并維持花粉的活力則至關(guān)重要。未開放的花苞（左）和剛剛開放的花朵（中），花粉具備活性，當(dāng)花蕊完全伸展后（右），花粉則不再具備活性。真菌孢子細(xì)胞與花粉粒具有高度相似性，因此也可以進(jìn)行類似的活性檢測，目前已檢測過的細(xì)胞有細(xì)菌、酵母、藻類、動物、人體等單細(xì)胞。下圖為不同來源的酵母活性的對比，如圖所示，鮮酵母活性較高；，而干燥酵母，即使于室溫下培育1小時，它的活性仍然比新鮮酵母低；取自啤酒的酵母細(xì)胞活性較差。如您需要了解更多信息，請點(diǎn)擊或掃描下方二維碼填寫登記表，我們會為您提供專業(yè)的服務(wù)，真誠期待與您的合作！
