自然條件下，植物常常處于光強快速變化的環(huán)境中。類似的狀況可能會導(dǎo)致光合作用電子傳遞速率和下游還原劑合成對電子的消耗速率不匹配，即光化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)化激發(fā)能供給的電子和暗反應(yīng)二氧化碳固定對還原劑消耗不協(xié)調(diào)。過剩的激發(fā)能和電子會誘發(fā)活性氧產(chǎn)生，增加光合作用系統(tǒng)損壞的風(fēng)險。幸運的是，植物已經(jīng)進化出了廣泛而有效的調(diào)節(jié)機制，使它們能夠應(yīng)對光強的波動，避免或減少光氧化脅迫。在光合電子傳遞鏈水平上主要有以下幾種短期光保護機制：1、狀態(tài)轉(zhuǎn)換，即光系統(tǒng)II捕光天線復(fù)合物L(fēng)HCII磷酸化/去磷酸化動態(tài)與PSII或PSI結(jié)合，實現(xiàn)PSII和PSI之間光吸收的優(yōu)化；2、替代電子傳遞途徑，即通過不同的替代電子傳遞通路重新分配電子流，主要包括由NADH脫氫酶樣復(fù)合物(NDH)或質(zhì)子梯度調(diào)節(jié)因子(PRG5-PGRL1)介導(dǎo)的環(huán)式電子傳遞(CET)；3、非光化學(xué)淬滅(NPQ)，即依賴類囊體腔酸化產(chǎn)生的ΔpH誘導(dǎo)的LHCII中過剩激發(fā)能的耗散，以保護光合作用裝置免受光氧化損傷；4、光合控制，由Cytb6f復(fù)合物為核心的電子傳遞調(diào)節(jié)機制，它通過類維持高類囊體腔ΔpH對Cytb6f中線性電子傳遞的質(zhì)體醌(PQH2f)氧化進行反饋調(diào)節(jié)，以實現(xiàn)控制電子傳遞的目的。這些機制如同精密的傳感器網(wǎng)絡(luò)，能在數(shù)秒至數(shù)分鐘內(nèi)動態(tài)響應(yīng)光照強度、溫度波動等環(huán)境變化。
http://doi.org/10.1093/plphys/kiac002
調(diào)控狀態(tài)轉(zhuǎn)換機制的元件包括STN7(衣藻中的同源蛋白為STT7)激酶和TAP38(也稱PPH1)去磷酸化酶。STN7激酶定位于類囊體基質(zhì)側(cè)，受PSII反應(yīng)中心氧化還原狀態(tài)調(diào)控。TAP38/PPH1磷酸酶依賴PSI側(cè)的低還原力環(huán)境激活。當(dāng)光環(huán)境更有利PSII光捕獲時，其激發(fā)能過剩會導(dǎo)致還原力堆積。此時，LHCII復(fù)合體通過STN7激酶介導(dǎo)的磷酸化修飾脫離PSII，遷移至PSI形成PSI-LHCI-LHCII超級復(fù)合體(狀態(tài)Ⅰ→狀態(tài)Ⅱ)。反之，當(dāng)光環(huán)境優(yōu)先激發(fā)PSI時，磷酸酶(如TAP38/PPH1)去除磷酸基團，LHCII回歸PSII(狀態(tài)Ⅱ→狀態(tài)Ⅰ)。
狀態(tài)轉(zhuǎn)換測量的經(jīng)典方法是77K熒光發(fā)射光譜，77k 熒光指的是在零下196度的溫度條件下觀測的葉綠素?zé)晒猓?7K下只有物理過程，沒有生化過程，這樣的低溫條件避免了與溫度有關(guān)的酶反應(yīng)和電子傳遞對熒光測量的影響，因此只有原初光化學(xué)反應(yīng)的變化才能被反映出來。目前77K 熒光常用于兩個光系統(tǒng)之間狀態(tài)轉(zhuǎn)化的研究，反應(yīng)光能在兩個光系統(tǒng)間的分配。典型的77K熒光發(fā)射光譜有兩個峰，分別是685-695nm和715-730nm，其中后者長波熒光峰是PSI的重要表征，已經(jīng)確定它是PSⅠ的捕光色素蛋白復(fù)合物L(fēng)HC I上的Chla發(fā)出的熒光。通過測量不同光環(huán)境誘導(dǎo)條件下制備樣品的77K熒光發(fā)射光譜，可以判斷光系統(tǒng)處于狀態(tài)I或者狀態(tài)II，通過光譜曲線的振幅可以衡量狀態(tài)轉(zhuǎn)換活性的高低。
The Chlamydomonas Sourcebook: Organellar and Metabolic Processes
除此之外，也可以用PAM葉綠素?zé)晒鈨x來測量狀態(tài)轉(zhuǎn)換。它的原理很簡單，即狀態(tài)I時LHCII在光系統(tǒng)II，此時PSII天線尺寸正常，F(xiàn)m’正常。狀態(tài)I到狀態(tài)II的轉(zhuǎn)換導(dǎo)致PS II天線尺寸變小和較低的Fm值。因此只需要在紅光-遠紅光-紅光-遠紅光的交替照光序列下連續(xù)記錄F和Fm’的變化，即可用曲線的動態(tài)變化來表征狀態(tài)轉(zhuǎn)換的發(fā)生和強度。
PAM葉綠素?zé)晒鈨x測量狀態(tài)轉(zhuǎn)化的文獻實例
DOI：10.1104/pp.20.00850
被子植物中有兩種部分冗余的CET途徑，這兩種途徑都依賴鐵氧還蛋白(Fd)還原PQ。在藍藻和C4植物中，CET主要是由葉綠體NADPH脫氫酶類(NDH)復(fù)合物介導(dǎo)；而在C3植物中，CET主要是由PGR5/PGRL1(質(zhì)子梯度調(diào)控蛋白5/質(zhì)子梯度調(diào)節(jié)類蛋白1)介導(dǎo)。當(dāng)光反應(yīng)產(chǎn)生還原劑(NADPH)的速率與暗反應(yīng)固定二氧化碳消耗還原劑的速率不協(xié)調(diào)時，當(dāng)線性電子傳遞受阻時，環(huán)式電子傳遞通過NDH復(fù)合體或PGR5-PGRL1通路將電子從鐵氧還蛋白(Fd)回傳至質(zhì)體醌(PQ)庫，維持跨膜質(zhì)子梯度(ΔpH)，為ATP合成提供動力。其中NDH依賴途徑類似線粒體復(fù)合體I，催化PQ還原并泵送質(zhì)子。PGR5-PGRL1途徑通過Fd-PQ氧化還原循環(huán)，不直接參與質(zhì)子轉(zhuǎn)運。NDH復(fù)合體嵌入類囊體膜基質(zhì)側(cè)，由ndh基因家族編碼。PGR5-PGRL1定位于類囊體非堆疊區(qū)，受光強和ROS信號誘導(dǎo)。
圖片來自《光合作用研究技術(shù)》
圍繞PSI的環(huán)式電子傳遞活性測定目前有兩種比較常用的方法：1、測量作用光關(guān)閉后的葉綠素?zé)晒馑矔r上升的方法(Post-illumination transient increase in chlorophyll fluorescence)，該方法主要用來測量NDH介導(dǎo)的環(huán)式電子傳遞，因此該方法也稱為NDH活性測量。該方法測量的流程非常簡單，使用暗適應(yīng)的葉片先在測量光下記錄最小熒光Fo，之后用光化光誘導(dǎo)樣品達到穩(wěn)態(tài)，最后關(guān)閉光化光記錄熒光信號的上升。根據(jù)作用光關(guān)閉后熒光信號上升曲線的斜率來評定循環(huán)電子傳遞的快慢，斜率越大，循環(huán)電子傳遞速率越快，反之越慢。2、測量P700+暗還原的方法(dark-reduction of P700+)。該方法基于的原理是所有環(huán)式電子傳遞的電子最終都會流回PSI供體測，因此可以通過測量氧化態(tài)P700+還原的速率來衡量環(huán)式電子傳遞。該方法的操作流程大致如下：首先用遠紅光將PSI氧化，產(chǎn)生P700+，等到PSI的氧化穩(wěn)定后，關(guān)閉遠紅光，記錄P700+信號的還原。計算遠紅光關(guān)閉后P700+暗還原的初速率(即0-1s的最大斜率)來反映循環(huán)電子傳遞速率的快慢，斜率越大，循環(huán)電子傳遞越快，反之越慢。
PAM熒光儀測量環(huán)式電子傳遞的文獻實例
DOI: 10.1038/NPLANTS.2015.225
NPQ的誘導(dǎo)主要由兩個關(guān)鍵因素介導(dǎo)：玉米黃質(zhì)和PsbS蛋白。玉米黃質(zhì)由紫黃質(zhì)通過紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶(VDE，也稱為NPQ1)轉(zhuǎn)化而來，其水平由葉黃素循環(huán)中兩種酶活性的平衡決定，即VDE將紫黃質(zhì)轉(zhuǎn)化為玉米黃質(zhì)，而玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶(ZEP或NPQ2)則介導(dǎo)反向的逆反應(yīng)。PsbS(也稱為NPQ4)是一種類囊體膜蛋白，不結(jié)合色素，其激活涉及光誘導(dǎo)的單體化，伴隨著PSII天線的重組和與LHCII三聚體的結(jié)合。NPQ通過葉黃素循環(huán)和PsbS蛋白構(gòu)象變化將LHCII捕獲的過剩光能以熱能形式耗散。紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶(VDE)激活，將紫黃質(zhì)(V)轉(zhuǎn)化為玉米黃質(zhì)(Z)，增強LHCII淬滅效率。PsbS蛋白質(zhì)子化誘導(dǎo)LHCII寡聚化，形成能量耗散位點。VDE/ZE：分別位于類囊體腔和基質(zhì)，受pH和抗壞血酸調(diào)控。PsbS由PsbS基因編碼，定位于類囊體膜。
https://doi.org/10.1104/pp.125.4.1558
NPQ的測量一般通過PAM葉綠素?zé)晒鈨x測量#誘導(dǎo)曲線(#暗弛豫)進行淬滅分析來完成。測量必須使用暗適應(yīng)的葉片來進行，因為暗適應(yīng)的樣品默認NPQ=0。流程大致如下，使用暗適應(yīng)的葉片進行測量，首先在低強度的測量光下測量Fo，施加飽和脈沖測量暗適應(yīng)的最大熒光Fm，然后用光化光誘導(dǎo)樣品達到穩(wěn)態(tài)，施加飽和脈沖測量穩(wěn)態(tài)熒光Fs和光下的最大熒光Fm’,然后根據(jù)公式NPQ=(Fm-Fm’)/Fm’計算NPQ。如果在誘導(dǎo)曲線后將光化光關(guān)掉，可以通繼續(xù)記錄NPQ的弛豫過程，將NPQ根據(jù)弛豫時間的快慢細分為qE，qT，qI等組分。
https://doi.org/10.1093/plcell/koae133
光合控制可以通過PAM葉綠素?zé)晒?P700差示吸收來測量。葉綠素?zé)晒鈪?shù)中的光化學(xué)淬滅qP可以用來表征開放態(tài)的光系統(tǒng)II反應(yīng)中心所占的比例，qP越大，開放的反應(yīng)中心比例越大。光系統(tǒng)的開放和關(guān)閉是由PSII電子受體QA氧化還原狀態(tài)決定的，因此QA氧化還原狀態(tài)也可以通過qP來指示。QA處于氧化態(tài)的越多，開放的反應(yīng)中心比例越大，qP越大；QA處于還原態(tài)的越多，開放的反應(yīng)中心比例越小，qP越小。P700red是PSI氧化還原過程中仍處于還原態(tài)的P700比例。當(dāng)光強升高導(dǎo)致過高的線性電子傳輸速率和更酸的類囊體腔環(huán)境而誘發(fā)光合控制時，質(zhì)體醌PQH2在Cytb6f處的氧化變慢。這將導(dǎo)致QA被過度還原，而P700被大量氧化，對應(yīng)到葉綠素?zé)晒鈪?shù)上即為qP數(shù)值小，P700red數(shù)值也小。因此，qP和還原態(tài)P700之間的關(guān)系可以用于衡量光合控制的程度。
實際應(yīng)用中，使用雙通道葉綠素?zé)晒鈨xDUAL-PAM -100或四通道動態(tài)LED陣列近紅外光譜儀DUAL-KLAS-NIR在中等光化光強度下同時測量PSII熒光和PSI氧化還原。用光化學(xué)淬滅參數(shù) qP作為 QA氧化還原狀態(tài)指示(縱坐標(biāo))，制作它與P700 還原百分比(橫坐標(biāo))關(guān)系，可以表征光合控制。 在此基礎(chǔ)上使用P515/535模塊測量跨類囊體膜ΔpH，對光合控制的分析將會更系統(tǒng)和完整。
上圖是用266μmolm?2s?1的中等強度光強測量33種植物葉片來表征光合控制的結(jié)果。在該光強下，具有有限電子傳遞和Calvin-Benson循環(huán)能力的陰生葉片已經(jīng)受到光合控制的強烈影響(左下，靠近坐標(biāo)軸交點的數(shù)據(jù))，而具有較大電子傳遞和Calvin-Benson 循環(huán)能力的陽生葉片則受到光合控制的影響較輕(右上)。圖片來源：https://doi.org/10.1007/s11120-022-00934-7.
DOI: 10.1134/S0006297923100036
即便是以上正文里四種機制并非孤立運作的。例如強光條件下，NPQ的快速啟動(qE)可以作為耗散過剩激發(fā)能的首選(響應(yīng)時間<1分鐘)，同時CET提升ΔpH(5-10分鐘激活)，而狀態(tài)轉(zhuǎn)換(需15-30分鐘)則作為中長期補償。這種多層次、動態(tài)響應(yīng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，使得植物能在瞬息萬變的環(huán)境中維持光合效率與生存能力的精妙平衡。
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