Ampha Z32阻抗流式細胞儀（IFC）可在單細胞水平上快速表征大量細胞活性狀態(tài)。測試全過程無需使用任何標記物和染料，基于懸浮液中單細胞本身的電阻抗特性，實現(xiàn)對細胞活性的在線、高通量、快速、無損檢測。本實驗使用Ampha Z32阻抗流式細胞儀（IFC）測試了不同培養(yǎng)狀態(tài)下BL2細胞（起源于Burkitt淋巴瘤）的活性和濃度，并觀察了細胞凋亡過程的阻抗相位響應(yīng)。
Ampha Z32阻抗流式細胞儀（IFC）核心部件是微流控芯片，當懸浮的細胞被泵入微芯片后，在外加交流電場作用下，不同活性狀態(tài)的細胞會產(chǎn)生不同的阻抗信號。細胞大小、細胞膜活性（離子泵）、細胞內(nèi)部特性（如液泡或脂質(zhì)外殼）都會影響細胞所產(chǎn)生的阻抗信號。在變化的電場頻率下，儀器即可捕捉到細胞的這些特性，本儀器可以在0.3-30MHz范圍內(nèi)的電場頻率下同時檢測4個不同頻率下細胞的電阻抗特性，如低頻（0.1-0.5MHz）和中頻（0.5-5MHz）分別捕捉有關(guān)細胞體積和細胞膜性能的信息，而更高頻率（>5MHz）中則更傾向于探測細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和細胞質(zhì)特性。
圖1 A）Ampha Z32阻抗流式細胞儀；B）微流控芯片
阻抗原始信號由實部（電阻）和虛部（容性電抗）組成（圖2B），經(jīng)信號分析后在AmphaSoft軟件中以相位-振幅散點圖的形式輸出（圖3）。散點圖上每個數(shù)據(jù)點對應(yīng)一個測細胞的阻抗響應(yīng)。根據(jù)樣品細胞濃度的不同，每秒可以分析數(shù)百到上千個細胞。
圖2 BL2細胞的阻抗信號
A) 每秒的原始信號。每個振幅對應(yīng)于細胞通過微流控芯片電場時的信號。B) 部分原始信號的放大，顯示了兩個活細胞和一個死細胞的阻抗響應(yīng)。原始信號由實部（藍線）和虛部（綠線）組成。通過識別實部和虛部信號的峰值，換算成每個細胞的相位角和振幅。
AmphaSoft軟件可直觀的輸出每個測試樣品的相位-振幅散點圖，并進行活性-失活類群分析、不同樣品的疊加分析以及選定類群的統(tǒng)計分析，并可以.CSV，.HTML及.PNG格式輸出綜合報告和結(jié)果。此外，針對不同樣品的測試模板方便用于同系列和同類型樣品的重復(fù)測量和比較。
圖3 BL2的相位-振幅散點圖
如圖3所示，在10 MHz測量頻率下，該培養(yǎng)狀態(tài)的BL2細胞的活性為83.37%。相位-振幅散點圖的頂部和右側(cè)分別顯示了相位直方圖和振幅直方圖。當使用多個頻率測量細胞時，AmphaSoft軟件可在同一個界面輸出每個頻率的測量結(jié)果，直觀對比細胞對不同頻率的阻抗響應(yīng)。上圖散點圖中的左側(cè)類群對應(yīng)于死細胞，而右側(cè)類群對應(yīng)于活細胞。顏色差異顯示了細胞的密集程度。
Ampha Z32的測試流程
Ampha Z32測量過程無需對細胞進行染色標記，且樣品的使用量很小。測量前只需經(jīng)過稀釋、添加測量緩沖液和過濾三個步驟。
（一）從細胞培養(yǎng)液中取樣，通常僅需50–100μl；
（二）根據(jù)細胞類型和應(yīng)用，選取合適的測量緩沖液稀釋樣品；
對于BL2細胞而言，使用AF6測量緩沖液。通常，如果直接從培養(yǎng)液中提取樣品，則建議在1:1到1:10之間稀釋。
（三）過濾以去除顆粒團塊；此步驟取決于細胞培養(yǎng)物的大小、純度以及顆粒與芯片通道橫截面的比率。
對于BL2細胞，不需要過濾步驟。
（四）上樣測量；測試過程全自動，并在達到某個設(shè)定停止條件（時間、細胞數(shù)量、體積）或用戶手動停止測量時結(jié)束。
不同培養(yǎng)時期BL2細胞的活力
活的和失活的BL2細胞的阻抗信號有明顯的差異（圖2B）。在相位-振幅點圖中，兩者歸屬于不同的散點云類群。失活細胞在低阻抗相位角形成一個封閉的云群，而活細胞通常在高阻抗相位角形成一個分布更廣泛的云群。對處于不同培養(yǎng)時期的細胞，隨著細胞開始凋亡和死亡，活細胞云群的相位角逐漸減小。
圖4 不同培養(yǎng)時期BL2細胞的活力分析
圖5 不同培養(yǎng)時期BL2細胞的阻抗相位和細胞活力的變化
圖5顯示BL2細胞在培養(yǎng)的0、1、2和6天內(nèi)阻抗相位和細胞活力的變化。從圖中可以看到，在第1天之后，BL2活細胞群發(fā)生明顯相移且細胞活力的急劇下降。
BL2細胞濃度
除了細胞活力之外，Ampha Z32阻抗流式細胞儀還可準確測量BL2的總細胞數(shù)、活細胞和死細胞濃度。為了確定濃度的線性測量范圍，本實驗制備了一系列稀釋液。
● 以1,500rpm的轉(zhuǎn)速將細胞離心2分鐘來收集BL2細胞樣品，然后棄去上清液并用新鮮的測量緩沖液重新懸浮細胞。
● 之后按1:3、1:9和 1:27稀釋濃度制備稀釋液，并重復(fù)測量三次。
● 使用Neubauer計數(shù)板對1:3稀釋液進行定量。
一系列稀釋液的測量結(jié)果顯示如圖6A所示，兩種檢測方法的計數(shù)結(jié)果顯示出高度的線性一致性。然而高濃度細胞（> 2×106個cells/ml）會導致Ampha Z32的阻抗信號重疊，這是由于高濃度下，多個細胞容易緊密通過或重合通過微流控芯片（圖5C），這將導致細胞濃度被低估。此時可使用測量緩沖液調(diào)整稀釋倍數(shù)，使樣品濃度達到合適的測定范圍。圖5B中的結(jié)果表明Ampha Z32活力測定結(jié)果的可重復(fù)性極高，且不受細胞濃度影響。
圖6 Ampha Z32測試的合理濃度范圍
A) IFC法與Neubauer計數(shù)板的相關(guān)性分析（n=3，sd=±3%）；B) 不同稀釋倍數(shù)下的細胞活力，細胞活力不受細胞濃度的影響（非配對t檢驗，p>0.05）;C) 原始樣品和按1:27稀釋后，細胞阻抗信號示例（2MHz頻率下）。高濃度原始樣本出現(xiàn)干擾信號（最左邊的信號）和雙峰信號（虛線框），這是由于細胞緊密通過或重合通過微流控芯片。相比之下，1:27稀釋后的樣品具有更明顯和離散的粒子信號。
BL2細胞的凋亡過程
Staurosporine是一種蛋白激酶抑制劑和細胞凋亡誘導劑。圖7顯示在Staurosporine誘導下，BL2活細胞群的阻抗信號變化（相移），直到細胞全部死亡。
從該誘導過程（圖7）以及培養(yǎng)過程（圖4A）中細胞阻抗信號的變化可以發(fā)現(xiàn)，在整個細胞凋亡過程中，細胞從高相位角（≈325°，活細胞和增殖細胞）經(jīng)中間過渡狀態(tài)（細胞凋亡）到低相位角（≈235°，死細胞）。因此，相位角可以作為指示細胞狀態(tài)的一個有效指標。
圖7 Staurosporine誘導下BL2細胞的凋亡過程
A）Staurosporine誘導后，BL2細胞相位直方圖隨時間的變化?；罴毎涸谡T導初期(t<10min)快速發(fā)生相移，之后穩(wěn)步發(fā)生變化，直到細胞開始死亡(t>1.5h)。該相位直方圖10MHz電場頻率下獲得。B）Staurosporine誘導的50個小時內(nèi)，BL2細胞活力的變化過程。從圖中可以看出，接觸Staurosporine誘導1.5h后，BL2細胞的活力迅速下降，此時對照組（DMSO誘導）BL2細胞仍處于生長狀態(tài)。18h后，對照組BL2細胞活力才開始降低。
結(jié)論
本次實驗結(jié)果表明，Ampha Z32阻抗流式細胞儀是一種在單細胞水平上測量細胞電特性的強大的無標記檢測方法，并可以>1,000個Cells/s的采集速率實現(xiàn)細胞的高通量檢測。每個細胞的測量阻抗數(shù)據(jù)實時顯示在相位-振幅散點圖中，測量結(jié)束后可以快速識別和量化活細胞和死細胞，并獲得各自的細胞濃度。此外，根據(jù)阻抗相位的變化還可準確預(yù)判細胞狀態(tài)，即細胞的存活、凋亡或死亡。
因此，我們認為Ampha Z32阻抗流式細胞儀（IFC）是一種可以無標記、快速表征細胞狀態(tài)的檢測技術(shù)，在監(jiān)測細胞培養(yǎng)物的濃度和活力、對凋亡誘導劑、細胞毒劑或其他試劑的劑量反應(yīng)或反映進程中有著廣闊的應(yīng)用前景。
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